淺談凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)的原理及注意事項

蛋白質(zhì)測定常用的方法是凱氏定氮法，它是通過測定氮含量從而換算成蛋白質(zhì)的方法，是國際上通用的標準方法，其優(yōu)點為實驗操作簡單、方便，測量結(jié)果的重復(fù)性和重現(xiàn)性好，而被廣泛應(yīng)用于各類食品、谷物、飼料等樣品的蛋白質(zhì)含量測定中。凱氏定氮法分為常量、半微量、微量法三種方法，其原理是食品中的蛋白質(zhì)在催化加熱條件下被分解，產(chǎn)生的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨。堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后以硫酸或鹽酸標準滴定溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量乘以換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)的含量。該方法有取樣、樣品消化、蒸餾、滴定四個步驟，其原理較為復(fù)雜，使用的試劑也比較多，以下將對這四個步驟進行簡單講述。

1 樣品的取樣

取樣應(yīng)具有代表性，取樣前將樣品充分混勻，固體試樣可用粉碎設(shè)備制成細小均勻粉末。稱量放入凱氏定氮瓶時，切勿使樣品粘附在瓶頸部，避免樣品未消化完全而造成氮損失。

2 樣品的消化（推薦使用阿爾瓦消解儀）

樣品中含氮有機化合物經(jīng)硫酸在加熱的條件下消化，硫酸的作用促使有機物脫水炭化。含氮的有機物炭化并生成碳，碳在將硫酸還原為二氧化硫的反應(yīng)中，自身則被氧化成為二氧化碳；反應(yīng)過程中產(chǎn)生的二氧化硫?qū)⒌€原為氨氣，此過程中其自身則被氧化成三氧化硫；而消化過程生成的氫，又加速了氨的形成。生成的水以水蒸氣的形式連同反應(yīng)過程中生成的三氧化硫一同逸出，而氨氣則以硫酸銨的形式留在消化液中。

化學(xué)反應(yīng)方程式為：

2NH2(CH2)2COOH＋13H2 SO4→(NH4)2SO4＋CO2↑＋SO2↑＋16H2O

此過程的注意事項：①樣品消化時，對于含糖量很高或含脂量較多的樣品，應(yīng)注意要緩慢升溫加熱，并隨時注意控制加熱的溫度，避免產(chǎn)生大量泡沫噴出或噴濺到瓶壁上，造成樣品的損失。若因加熱溫度不當(dāng)，局部溫度過高使消化液噴濺到瓶壁上，應(yīng)及時轉(zhuǎn)動凱氏定氮瓶將濺到瓶壁上的樣品消化液沖下，也可在樣品消化前加入少量辛醇或液體石蠟，以減少泡沫的產(chǎn)生。②消化時應(yīng)不定時旋轉(zhuǎn)凱氏定氮瓶，將附在瓶壁上的碳粒沖下，使樣品充分消化。③若樣品難以消化至澄清透明的程度，可將凱氏定氮瓶從加熱器上取下，待其中溶液冷卻至室溫后，向消化液中加入少量過氧化氫，再繼續(xù)加熱直至完全消化。④整個消化過程中硫酸的量要充足，以保證樣品中含氮有機化合物的徹底消化。樣品中脂肪含量過高時，要增加硫酸的量，因消化時脂肪消耗硫酸的量較大，使硫酸缺少而影響測定。⑤在樣品消化末期，即消化液呈藍綠色并澄清透明后，再繼續(xù)加熱半小時即可，因此時瓶內(nèi)消化液溫度過高，若長時間加熱，會使生成的硫酸氫銨分解并釋放出氨氣，使氮的含量損失，從而影響測定結(jié)果。

3 蒸餾

化學(xué)反應(yīng)方程式為：

（NH4）2SO4＋NaOH→Na2SO4＋NH3↑＋H2O

注意事項：①水蒸氣發(fā)生器中的水要呈酸性，因水中可能含有微量的氨離子，防止其受熱溢出而影響測定結(jié)果。②蒸餾反應(yīng)過程中，硫酸銨為強酸弱堿鹽，可使消化液為弱酸性溶液。為保證測量結(jié)果的準確性，務(wù)必使結(jié)合態(tài)的氨能完全反應(yīng)并釋放出來，因此整個蒸餾過程中，堿液的量不足，酸堿中和反應(yīng)則不徹底，很難達到使氨充分分離的目的，從而使測量結(jié)果不準確。氫氧化鈉溶液既能中和樣品消化液中過量的酸，又可為氨的有效分離提供一個堿性環(huán)境，因此氫氧化鈉的用量要控制適當(dāng)。實驗者可利用消化液中含有的銅離子，根據(jù)其特征顏色作為堿性反應(yīng)的指示劑。當(dāng)反應(yīng)室內(nèi)加入氫氧化鈉溶液后，其溶液顏色立即變?yōu)樗{黑色時，表明氫氧化鈉已過量，能達到酸堿反應(yīng)的要求，可保證反應(yīng)完全進行。③加氫氧化鈉的漏斗要采用水封，避免因蒸餾裝置漏氣造成氨的溢出而影響測定結(jié)果。

4 滴定

氨以氣體的形式被釋放出來，用硼酸溶液吸收后，使用鹽酸或硫酸標準滴定液進行酸堿滴定，從而計算出樣品中蛋白質(zhì)的含量。此過程的注意事項：①硼酸吸收液的溫度不宜過高，過高則氨的吸收能力將減弱，會影響測量結(jié)果，使結(jié)果偏低。保持溶液溫度在20℃以下，或?qū)⒔邮掌恐糜诶渌≈小＂谂鹚嵛找旱捏w積不使用精密量取，只要保證能將氨全部吸收即可，因為硼酸的酸性很弱，不會影響滴定。③滴定用的標準滴定液必須按照要求進行配制和標定，因其準確度直接影響測量結(jié)果的準確性。④計算蛋白質(zhì)的含量時須乘以氮換算蛋白質(zhì)的系數(shù)，一般食物為6.25。

5 小結(jié)

新鮮食品中的含氮化合物大都以蛋白質(zhì)為主體，所以檢驗食品中的蛋白質(zhì)含量時，只限于測定總氮量，然后乘以蛋白質(zhì)換算系數(shù)6.25，即可得到蛋白質(zhì)含量。凱氏定氮法可用于所有動、植物食品的蛋白質(zhì)含量測定，因樣品中常含有核酸、生物堿等以及含氮色素等非蛋白質(zhì)的含氮化合物，所以該法測定結(jié)果為粗蛋白質(zhì)含量。筆者通過參加國家機構(gòu)組織的“食品中蛋白質(zhì)的測定”能力檢驗證，以反復(fù)實驗為基礎(chǔ)，在實驗過程中摸索可能影響實驗結(jié)果的關(guān)鍵點和注意事項，嚴格把握實驗原理，多次推敲與總結(jié)，得到上述實驗經(jīng)驗。
以上過程現(xiàn)在均可由機器完成，阿爾瓦凱氏定氮儀KN系列就很好的替代了手工測樣，并且測定結(jié)果優(yōu)于手工測試！